Semana 3 (29 de mayo)

Esta fue nuestra segunda semana de espectrofotometría. De nuevo utilizamos los métodos de Lowry y Bradford para determinar proteínas, pero esta vez yo hice el primero y Mauro el segundo. Más seguros que la vez pasada y habiendo repasado nuestros errores, obtuvimos resultados mucho mejores.

Seguimos descubriendo instrumentos muy útiles: una propipeta a ruedita (se usa la ruedita de la parte de arriba para bajar o subir líquidos) y el dispenser (un dispositivo que sirve para pipetear varias veces cargando una sola).

La próxima semana: desalado de una solución (proceso necesario para obtener buenos resultados en la electroforesis)

Semanas 1 y 2 (Jueves 15 y 22 de Mayo)

En la primera semana de este proyecto conocimos a las investigadoras Marta Mazzetti y Laura Matkovic', junto a las cuales vamos a aprender a trabajar durante el año. Nos explicaron las bases, síntomas, tratamientos y mitos relacionados con la porfiria (una de las enfermedades a estudiar).

En el laboratorio realizamos una determinación de proteinas por los métodos de Bradford y Lowry.

Determinamos las absorbancias de las muestras a la longitud de onda que correspondía a cada método, en un espectrofotometro de doble haz.
La semana que viene vamos a intercambiar los métodos. También aprendimos cómo confeccionar los protocolos de laboratorio, y cómo trabajar de acuerdo a las normas de Higiene y Seguridad.

Detallamos a continuación el trabajo realizado junto a una pequeña introducción al tema.


Dosaje de proteínas

El dosaje de proteínas es una etapa muy importante dentro de un esquema de purificación. A través de la cuantificación de la proteína podremos localizar a esta en una u otra fracción de un proceso de separación, y de esta manera podremos medir la actividad biológica de la misma. Los distintos métodos de dosaje de proteínas deberían responder a criterios específicos, los cuales determinarán que sean utilizados a lo largo del proceso de purificación o para el control de calidad. Durante el proceso de purificación, el dosaje debe ser rápido y fácil de poner en práctica, mientras que el control de calidad requerirá una respuesta específica así como gran sensibilidad (medición de la actividad biológica, respuesta a los anticuerpos, ausencia de contaminantes).
Criterios importantes para una buena técnica de dosaje de proteínas:

1) Bajo umbral de detección.
2) Buena especificidad.
3) Facilidad de puesta en práctica.
4) Rapidez.
5) Costo no muy elevado.
6) Fácil integración en un protocolo de purificación.

Frecuentemente es necesario estimar la concentración de una mezcla de proteínas al cabo de una etapa de purificación o de fermentación (ya sea para calcular el rendimiento de la purificación como la producción de una proteína). Los diferentes métodos de dosaje de proteínas utilizan las propiedades físicas y químicas intrínsecas de las mismas. A continuación se resumen distintos métodos según el principio en el cual se basan.

a) Métodos espectrofotométricos:
· Medición de absorbancia
· Medición de fluorescencia

b) Métodos que involucran fijación a colorantes:
· Bradford (unión a coomassie blue)
· Fluorescamina (unión a fluorescamina)

c) Métodos en los que intervienen reacciones químicas:
· Lowry (reactivo de Folin)
· BCA (Ácido BiCinconínico)

d) Marcación radiactiva.


Los métodos que utilizamos fueron:


Método de Bradford

- Solución patrón:
Seroalbúmina bovina (BSA) en concentración 0,5 mg/mL.

Reactivos:
- Reactivo de Bradford (modificado): 40 mg de Coomassie Brilliant Blue G 250 + 50 mL etanol + 100 mL ácido fosfórico 85% y llevar a l litro con agua destilada.

Desarrollo de la metodología

Se preparan 5 pares de tubos que contengan desde 0,005 mg hasta 0,025 mg de proteínas y se llevan a 0,1 mL con agua destilada. Se añaden a cada tubo 2 mL de reactivo de Bradford, se agita bien y se lee en espectrofotómetro a 595 nm, luego de 2 minutos y antes de 1 hora. Se realiza un blanco con agua destilada en lugar de la solución de proteína. De la misma forma se procede con una muestra de concentración desconocida de proteína (muestra incógnita).

Protocolo Bradford




Resultados obtenidos por el grupo:





Método de Lowry y col.

- Solución patrón:
Seroalbúmina bovina (BSA) o tripsina en concentración de 0.5 mg/mL


Reactivos:
- Reactivo de Folin-Ciocalteau: se diluye según se especifique
- Solución alcalina de cobre: Se prepara mezclando las soluciones A, B y C en relación 0,1 A : 0,1 B : 10 C. La preparación debe realizarse mezclando primero A + B y recién después agregando C. Se prepara antes de usar y se descarta luego de un día.

A) Solución de tartrato de sodio y potasio al 2%
B) Solución de CuSO4. 5H20 al 1%
C) Solución de Na2CO3 al 2% en NaOH 0.1 N

Desarrollo de la metodología

Se preparan 5 pares de tubos que contengan desde 0,025 hasta 0,125 mg de proteína y se lleva cada tubo a 0,4 mL con agua destilada. Se añaden a cada tubo 2 mL de solución alcalina de cobre. Se mezcla bien y se deja en reposo durante 10 minutos, a temperatura ambiente. Se agregan 0,2 mL del reactivo de Folin, agitándose inmediatamente. Se deja 30 minutos a: temperatura ambiente y se lee a 660 nm. Como control se realiza un blanco que contiene agua destilada en lugar de proteína. De igual forma se procede para determinar la concentración de proteínas de una muestra incógnita.

Protocolo Lowry

Resultados obtenidos por el grupo:

Conclusiones:

Se puede medir proteínas por métodos indirectos (Lowry y Bradford). Estos son métodos indirectos ya que no se miden las proteínas directamente, sino, se las hacen reaccionar con los reactivos, para dar productos coloreados y se lo mide espectrofotometricamente.

Estos métodos son más efectivos que el método directo, que es medir a 280 nm ya que a longitudes de onda muy bajas, hay mucha interferencia y muchas sustancias se pueden confundir con proteínas.