Aspectos importantes para el estudio estructural de proteínas del metabolismo del hemo: porfobilinógeno deaminasa (PBG-D) o uroporfirinógeno sintetasa (URO-S)
Las técnicas aprendidas en el laboratorio referentes a la purificación de enzimas nos permiten presentar la siguiente tabla correspondiente a la purificación de la PBG-D.
Etapa
Volumen (ml)
Proteína (mg)
Actividad específica (nmol/h.mg)
Purificación (fold)
1. Homogenato
400
15.280
0,036
1
2. Sobrenadante 11.000 xg
320
8.645
0,054
1,5
3. Tratamiento de calor
278
1.902
0,230
6,4
4. (NH4)2SO4 ppt 35-60%
67
859
0,394
10,9
5. DEAE celulosa batch
95
134
1,694
47,1
6. Sephacryl S-200
32
15
8,920
247,8
7. Columna de DEAE celulosa
15
8
36,210
1.005,8
Figura 1: cromatografía de PBG-D en DEAE celulosa (DE-52, Whatman). Se recogieron fracciones de 3 ml a 1 ml/min. Las fracciones juntadas que contenían actividad de PBG-D (los tubos 46 a 50) fueron concentrados por ultra-filtración.
Fig. 2: SDS-PAGE de las diferentes etapas de la purificación. Luego de: 1-tratamiento de calor, 2-fraccionamiento con sulfato de amonio, 3-cromatografía con Sephacryl, 4-cromatografía con DEAE celulosa (pico), st-estándares de peso molecular.
Una vez purificada la proteína, la caracterizamos determinando el radio de Stokes.
Fig. 3: aproximación del radio de Stokes. Se aplicaron alícuotas (3ml) de enzima purificada y marcadores de proteína, 5mg cada uno, a una columna Sephadex G-100 (2,5x90cm) en buffer 0,1M fosfato y se diluyeron con el mismo buffer en fracciones de 4 ml. Se determinó la actividad de PBG-D (o). Los marcadores de proteína fueron seroalbúmina bovina dimérica (▲), seroalbúmina bovina monomérica (●), ovoalbúmina (■) y citocromo c (x). Se determinó el V0 usando blue-dextrano. Los radios de Stokes de los marcadores fueron representados versus (log Kav)1/2; siendo Kav = (Ve-V0)/(Vt-V0).
Siguiendo con la caracterización, determinamos también el coeficiente de sedimentación.
Fig. 4: estimación del coeficiente de sedimentación. Se prepararon gradientes lineales. La muestra fue disuelta en 250 μl y después de centrifugar se recogieron fracciones de 200 μl desde la parte inferior a la parte inferior de los tubos. Se midió la actividad de PBG-D (o) utilizando el ensayo enzimático habitual. Se usaron como marcadores peroxidasa (per), fosfatasa alcalina (FA) y citocromo c (cit c), y su posición se indica con (↓)
Finalmente, determinamos la composición aminoacídica de la PBG-D.
Aminoácido
Moles de residuos/mol de proteínaa
Asx
41,7
Thrb
29,6
Serb
33,2
Glx
59,2
Pro
18,6
Gly
41,8
Ala
30,6
Cysc
5,6
Val
20,6
Met
6,7
Ile
11,1
Leu
30,5
Tyr
9,7
Phe
12,8
Trp
n.d.d
Lys
18,8
His
8,4
Arg
14,5
a Residuos por mol de proteína (peso molecular: 42000).
b Valores obtenidos por extrapolación a tiempo de hidrólisis cero.
c Medido después de la oxidación con ácido perfórmico de las cistinas.
d n.d., no determinado.
Las muestras de enzima purificada (50 μg) fueron hidrolizadas bajo vacío en HCl 6 M conteniendo 1 mg/ml de fenol durante 20 a 40 horas a 110ºC para realizar un análisis aminoacídico. El contenido de cisteínas más cistinas se estimó como ácido cisteico luego de la oxidación con ácido perfórmico, anteriormente a la hjdrólisis. La composición aminoacídica se midió con un analizador de aminoácidos Beckman 119 CL.
Aspectos importantes en el metabolismo de la porfiria e hidratos de carbono
Se presentan resultados de ambos metabolismos ya que nuestro objetivo a descifrar es dilucidar por qué los pacientes porfíricos mejoran después de la administración de glucosa. Estos resultados corresponden a la actividad de las enzimas PEPCK, GP y ALA-S, y al contenido de los metabolitos ALA y PBG, que sirven como biomarcadores de la enfermedad.
Determinación de actividad enzimática: fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (PEPCK) y glucógeno fosforilasa (GP)
Objetivo: determinar la actividad enzimática de PEPCK y GP en hígado de rata, enzimas clave en el metabolismo de la glucosa, y de ALA-S, enzima clave en el metabolismo del hemo y el contenido hepático de ALA y PBG, metabolitos que sirven como biomarcadores de porfiria.
Procedimiento:
Medición PEPCK
Metodología para determinar la actividad enzimática de PEPCK(fosfoenolpiruvato carboxiquinasa)
Se empleó el método de Petrescu et al. (1).
Se realiza un homogenato de hígado 1:3 (Sacarosa 0,25M).
Se centrifuga a 12.000 g 20min en Sorval rotor SS36 para bajar núcleos y mitocondrias (ó 5500 y 12000 para separar mitocondrias limpias) y luego se ultracentrifuga a 105.000 g1,20 h (41200 rpm en Beckman rotor 90 Ti) para obtener citosol (fracción soluble) y microsomas (para ensayo G-6-Pasa).
ENSAYO: 12 ml Tris 125 mM pH 7,4
1,2 ml PEP 12,5 mM en H2O
1,2 ml MnCl 25 mM en H2O
1,2 ml NADH 0,2M en Tris
6 ml MalicoDh10 U/ml
2,25 ml H2O
USO 0,87 ml/tubo (ó directamente pipeteado en la cuba)
Agrego a cuba 40μl CO2 (bicarbonato 0,5 M burbujeado) ó H2O
Agrego 20 μl citosol (aprox. 30 mg/ml proteína)
Largo medición con 70 μl deoxyGDP
Mido cinética a 340 nm, lag 1”, int 5”, F1 por 120”
Medición GP
Metodología para determinar la actividad enzimática de Glucógeno fosforilasa (GP)
Se empleó el método de Leloir y Goldemberg (2).
Se realiza un homogenato de hígado 1:3 (Sacarosa 0,25M + EDTA 1mM).
Se centrifuga a 2.000 g 15min en Sorval rotor SS36 para bajar núcleos (ó 5500rpm)
Mido fosfatos a través de esta reacción colorimétrica:
50 μl sobrenadante de la centrifugación
250 μl H2O
700 μl de Reactivo reductor (RR)
Incubo 20 min a 45 º C
Mido fosfatos a 660 nm
Medición de ALA y PBG
Para estimar el contenido de ALA y PBG hepáticos, se desproteinizaron porciones de homogenato de hígado con 0.6 M TCA (Marver et al. 1966). Los sobrenadantes (0.3-1ml) se ajustaron a un pH 4.5-6.0. Se determinaron los contenidos por el método de Piper et al. (1973). Se utilizaron dos columnas diferentes: el PBG se eluyó de una columna de Dowex 1 con ácido acético 1M y el ALA se eluyó de una columna Dowex 50W con acetato de sodio luego de remover la urea. Se midieron colorimétricamente el pirrol formado a partir del ALA y PBG por el método de Mauzerall y Granick (3).
Medición de ALA-S
Se empleó el método de Marver (4).
Se realiza un homogenato de hígado 1:3 (buffer 10mM Tris-HCl pH 7,4 + 0,5 mM EDTA + 0.9% NaCl).
ENSAYO:0,5 ml homogenato
0,5 ml Glicina 0,4 M
0,2 ml EDTA 0,1 M
0,8 ml Tris 0,2M pH 7,4
Hacer blancos de muestrasolo con 0,5 ml buffer de homogenato a tiempo 0 y 60min
La reacción se frena con el agregado de 0,5ml de TCA 25%. Luego se centrifuga 15 min y se toma un ml del sobrenadante que se mezcla con 22 ml de NaOH saturado. Luego se agrega 1 ml de Buffer Acetato Na 0,1 M pH 4,6 y 50 μl Acetil Acetona y se calienta en agua hirviendo durante 10 min. Se enfría luego, se agregan 2 ml de reactivo de Ehrlich y se espera entre 7 y 10 min para leer a 553nm en espectrofotómetro. Lo que se forma es el ALA pirrol que se mide mediante su reacción con el reactivo de Ehrlich.
Reactivo de Ehrlich: 0,4 g pDMAB (para dimetilamino benzaldehido) + 12 ml Acético Glaciar + 3, 4 ml Perclórico 70% --- llevo a 20 ml con Acético Glaciar
Resultados:
Control
Grupo C
Animales tratados con AIA + DDC
Grupo B
Grupo M
Grupo A
ALA-S
(nmol ALA/g)
25,5 ± 2,7
33,90 ± 4,9 *
80,4 ± 7,7 # *
85,1 ± 6,7 § # *
ALA hepático
(nmol ALA/g)
7,5 ± 0,7
9,30 ± 0,90*
26,5 ± 1,7 # *
28,2 ± 1,9 # *
PBG hepático
(nmol PBG/g)
0,32 ± 0,02
2,43 ± 0,03 *
12,7 ± 1,1 # *
16,4 ± 1,7 § # *
Se inyectó a los animales subcutáneamente (sc) con tres dosis diferentes de AIA e intraperitonealmente (ip) con una dosis única de DDC, estableciendo los siguientes grupos: Grupo B, 100 mg AIA + 50 mg DDC/kg masa corporal; Grupo M, 250 mg AIA + 50 mg DDC/kg masa corporal; Grupo A, 500 mg AIA + 50 mg DDC/kg masa corporal. El grupo control (Grupo C) solo recibió los vehículos: solución salina, sc, y aceite de maíz, ip.
Cada barra representa el promedio ± SEM de 6 animales. La actividad es expresada como nmol NADH oxidado/mg. proteina.min. *Los valores difieren significativamente de los del grupo control.
En la figura 1 se observa disminución significativa (20%) de la actividad de la PEPCK en función de las dosis más altas respecto del control.
Fig. 1Dosis respuesta de actividad de PEPCK hepática al tratamiento de AIA/DDC.
En la figura 2 se observa una disminución de la actividad de la GP significativa para las dosis más altas (40% en la dosis media y 60% en la dosis alta).
Fig. 2 Dosis respuesta de actividad de GP hepática al tratamiento de AIA/DDC.
Se inyectó a los animales con las mismas dosis de AIA y DDC indicadas en la Fig. 1. Cada barra representa el promedio ± SEM de 6 animales. La actividad se expresa como μmol Pi/ g de hígado húmedo.min. *Los valores difieren significativamente de los del grupo control.
Conclusiones: estos resultados nos permiten especular que los pacientes porfíricos tienen niveles hepáticos de glucosa disponible disminuidos. Por otra parte, nos acercamos al conocimiento de los metabolitos que biomarcan una patología dada. Esto será el inicio del análisis de todos los metabolitos de bajo peso molecular importantes para la enfermedad que serán determinados posteriormente mediante técnicas utilizadas en metabolómica.
(1) Petrescu I, Bojan O, Saied M, Barzu O, Schmidt F, Kuhnle HF.Determination of phosphoenolpyruvate carboxykinase activity with deoxyguanosine 5'-diphosphate as nucleotide substrate.Anal Biochem. 1979 Jul 15; 96(2): 279-81. (PEPCK)
(2) Leloir L.F., Goldenmberg S.H. . Synthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose in liver. J. Biol Chem. (1960) 235:919-23
(3) MauzerallD,Granick S. The occurrence and determination of -aminolaevulinic acid and porphobilinogen. J Biol Chem 1956.
(4) Marver HS, Tschudy DP, Perlroth MG, Collins A. Delta-aminolevulinic acid synthetase. I. Studies in liver homogenates. 1966 J Biol Chem.; 241(12): 2803-9. (ALA-S)
En este blog haremos el seguimiento de nuestro proyecto final, que consiste en unirnos a un grupo de investigación sobre modelos experimentales de Porfiria y Síndrome Metabólico y aprender de qué tratan estos desórdenes y las diferentes técnicas que se usan en los laboratorios. Nos reunimos todos los jueves con las doctoras Marta Mazzetti y Laura Matkovic.
