25/09

Aspectos importantes en el metabolismo de la porfiria e hidratos de carbono

Se presentan resultados de ambos metabolismos ya que nuestro objetivo a descifrar es dilucidar por qué los pacientes porfíricos mejoran después de la administración de glucosa. Estos resultados corresponden a la actividad de las enzimas PEPCK, GP y ALA-S, y al contenido de los metabolitos ALA y PBG, que sirven como biomarcadores de la enfermedad.

Determinación de actividad enzimática: fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (PEPCK) y glucógeno fosforilasa (GP)

Objetivo: determinar la actividad enzimática de PEPCK y GP en hígado de rata, enzimas clave en el metabolismo de la glucosa, y de ALA-S, enzima clave en el metabolismo del hemo y el contenido hepático de ALA y PBG, metabolitos que sirven como biomarcadores de porfiria.

Procedimiento:

Medición PEPCK

Metodología para determinar la actividad enzimática de PEPCK (fosfoenolpiruvato carboxiquinasa)

Se empleó el método de Petrescu et al. (1).

Se realiza un homogenato de hígado 1:3 (Sacarosa 0,25M).

Se centrifuga a 12.000 g 20min en Sorval rotor SS36 para bajar núcleos y mitocondrias (ó 5500 y 12000 para separar mitocondrias limpias) y luego se ultracentrifuga a 105.000 g 1,20 h (41200 rpm en Beckman rotor 90 Ti) para obtener citosol (fracción soluble) y microsomas (para ensayo G-6-Pasa).

ENSAYO: 12 ml Tris 125 mM pH 7,4

1,2 ml PEP 12,5 mM en H2O

1,2 ml MnCl 25 mM en H2O

1,2 ml NADH 0,2M en Tris

6 ml MalicoDh 10 U/ml

2,25 ml H2O

USO 0,87 ml/tubo (ó directamente pipeteado en la cuba)

Agrego a cuba 40μl CO2 (bicarbonato 0,5 M burbujeado) ó H₂O

Agrego 20 μl citosol (aprox. 30 mg/ml proteína)

Largo medición con 70 μl deoxyGDP

Mido cinética a 340 nm, lag 1”, int 5”, F1 por 120”

Medición GP

Metodología para determinar la actividad enzimática de Glucógeno fosforilasa (GP)

Se empleó el método de Leloir y Goldemberg (2).

Se realiza un homogenato de hígado 1:3 (Sacarosa 0,25M + EDTA 1mM).

Se centrifuga a 2.000 g 15min en Sorval rotor SS36 para bajar núcleos (ó 5500rpm)

ENSAYO: 100 μl enzima (sobrenadante centrifugación)

100 ul Glu-1-P 0,2M

100 μl Buffer Citrato 0,5M pH6

100 ul Glucógeno 1,5%

Incubo 30 min a 30 º C

Freno con 2 ml TCA 5%

Centrifugo a 500 g 15 min en centrifuga de mesa

Mido fosfatos a través de esta reacción colorimétrica:

50 μl sobrenadante de la centrifugación

250 μl H2O

700 μl de Reactivo reductor (RR)

Incubo 20 min a 45 º C

Mido fosfatos a 660 nm

Medición de ALA y PBG

Para estimar el contenido de ALA y PBG hepáticos, se desproteinizaron porciones de homogenato de hígado con 0.6 M TCA (Marver et al. 1966). Los sobrenadantes (0.3-1ml) se ajustaron a un pH 4.5-6.0. Se determinaron los contenidos por el método de Piper et al. (1973). Se utilizaron dos columnas diferentes: el PBG se eluyó de una columna de Dowex 1 con ácido acético 1M y el ALA se eluyó de una columna Dowex 50W con acetato de sodio luego de remover la urea. Se midieron colorimétricamente el pirrol formado a partir del ALA y PBG por el método de Mauzerall y Granick (3).

Medición de ALA-S

Se empleó el método de Marver (4).

Se realiza un homogenato de hígado 1:3 (buffer 10mM Tris-HCl pH 7,4 + 0,5 mM EDTA + 0.9% NaCl).

ENSAYO: 0,5 ml homogenato

0,5 ml Glicina 0,4 M

0,2 ml EDTA 0,1 M

0,8 ml Tris 0,2M pH 7,4

Hacer blancos de muestra solo con 0,5 ml buffer de homogenato a tiempo 0 y 60 min

La reacción se frena con el agregado de 0,5ml de TCA 25%. Luego se centrifuga 15 min y se toma un ml del sobrenadante que se mezcla con 22 ml de NaOH saturado. Luego se agrega 1 ml de Buffer Acetato Na 0,1 M pH 4,6 y 50 μl Acetil Acetona y se calienta en agua hirviendo durante 10 min. Se enfría luego, se agregan 2 ml de reactivo de Ehrlich y se espera entre 7 y 10 min para leer a 553nm en espectrofotómetro. Lo que se forma es el ALA pirrol que se mide mediante su reacción con el reactivo de Ehrlich.

Reactivo de Ehrlich: 0,4 g pDMAB (para dimetilamino benzaldehido) + 12 ml Acético Glaciar + 3, 4 ml Perclórico 70% --- llevo a 20 ml con Acético Glaciar

Resultados:

	Control Grupo C	Animales tratados con AIA + DDC
		Grupo B	Grupo M	Grupo A
ALA-S (nmol ALA/g)	25,5 ± 2,7	33,90 ± 4,9 *	80,4 ± 7,7 # *	85,1 ± 6,7 § # *
ALA hepático (nmol ALA/g)	7,5 ± 0,7	9,30 ± 0,90*	26,5 ± 1,7 # *	28,2 ± 1,9 # *
PBG hepático (nmol PBG/g)	0,32 ± 0,02	2,43 ± 0,03 *	12,7 ± 1,1 # *	16,4 ± 1,7 § # *

Se inyectó a los animales subcutáneamente (sc) con tres dosis diferentes de AIA e intraperitonealmente (ip) con una dosis única de DDC, estableciendo los siguientes grupos: Grupo B, 100 mg AIA + 50 mg DDC/kg masa corporal; Grupo M, 250 mg AIA + 50 mg DDC/kg masa corporal; Grupo A, 500 mg AIA + 50 mg DDC/kg masa corporal. El grupo control (Grupo C) solo recibió los vehículos: solución salina, sc, y aceite de maíz, ip.

Cada barra representa el promedio ± SEM de 6 animales. La actividad es expresada como nmol NADH oxidado/mg. proteina.min. *Los valores difieren significativamente de los del grupo control.

En la figura 1 se observa disminución significativa (20%) de la actividad de la PEPCK en función de las dosis más altas respecto del control.

Fig. 1 Dosis respuesta de actividad de PEPCK hepática al tratamiento de AIA/DDC.

En la figura 2 se observa una disminución de la actividad de la GP significativa para las dosis más altas (40% en la dosis media y 60% en la dosis alta).

Fig. 2 Dosis respuesta de actividad de GP hepática al tratamiento de AIA/DDC.

Se inyectó a los animales con las mismas dosis de AIA y DDC indicadas en la Fig. 1. Cada barra representa el promedio ± SEM de 6 animales. La actividad se expresa como μmol Pi/ g de hígado húmedo.min. *Los valores difieren significativamente de los del grupo control.

Conclusiones: estos resultados nos permiten especular que los pacientes porfíricos tienen niveles hepáticos de glucosa disponible disminuidos. Por otra parte, nos acercamos al conocimiento de los metabolitos que biomarcan una patología dada. Esto será el inicio del análisis de todos los metabolitos de bajo peso molecular importantes para la enfermedad que serán determinados posteriormente mediante técnicas utilizadas en metabolómica.

(1) Petrescu I, Bojan O, Saied M, Barzu O, Schmidt F, Kuhnle HF. Determination of phosphoenolpyruvate carboxykinase activity with deoxyguanosine 5'-diphosphate as nucleotide substrate. Anal Biochem. 1979 Jul 15; 96(2): 279-81. (PEPCK)

(2) Leloir L.F., Goldenmberg S.H. . Synthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose in liver. J. Biol Chem. (1960) 235:919-23

(3) Mauzerall D, Granick S. The occurrence and determination of -aminolaevulinic acid and porphobilinogen. J Biol Chem 1956.

(4) Marver HS, Tschudy DP, Perlroth MG, Collins A. Delta-aminolevulinic acid synthetase. I. Studies in liver homogenates. 1966 J Biol Chem.; 241(12): 2803-9. (ALA-S)