02/10

Aspectos importantes para el estudio estructural de proteínas del metabolismo del hemo: porfobilinógeno deaminasa (PBG-D) o uroporfirinógeno sintetasa (URO-S)

Las técnicas aprendidas en el laboratorio referentes a la purificación de enzimas nos permiten presentar la siguiente tabla correspondiente a la purificación de la PBG-D.

Etapa	Volumen (ml)	Proteína (mg)	Actividad específica (nmol/h.mg)	Purificación (fold)
1. Homogenato	400	15.280	0,036	1
2. Sobrenadante 11.000 xg	320	8.645	0,054	1,5
3. Tratamiento de calor	278	1.902	0,230	6,4
4. (NH4)2SO4 ppt 35-60%	67	859	0,394	10,9
5. DEAE celulosa batch	95	134	1,694	47,1
6. Sephacryl S-200	32	15	8,920	247,8
7. Columna de DEAE celulosa	15	8	36,210	1.005,8

Figura 1: cromatografía de PBG-D en DEAE celulosa (DE-52, Whatman). Se recogieron fracciones de 3 ml a 1 ml/min. Las fracciones juntadas que contenían actividad de PBG-D (los tubos 46 a 50) fueron concentrados por ultra-filtración.

Fig. 2: SDS-PAGE de las diferentes etapas de la purificación. Luego de: 1-tratamiento de calor, 2-fraccionamiento con sulfato de amonio, 3-cromatografía con Sephacryl, 4-cromatografía con DEAE celulosa (pico), st-estándares de peso molecular.

Una vez purificada la proteína, la caracterizamos determinando el radio de Stokes.

Fig. 3: aproximación del radio de Stokes. Se aplicaron alícuotas (3ml) de enzima purificada y marcadores de proteína, 5mg cada uno, a una columna Sephadex G-100 (2,5x90cm) en buffer 0,1M fosfato y se diluyeron con el mismo buffer en fracciones de 4 ml. Se determinó la actividad de PBG-D (o). Los marcadores de proteína fueron seroalbúmina bovina dimérica (▲), seroalbúmina bovina monomérica (●), ovoalbúmina (■) y citocromo c (x). Se determinó el V₀ usando blue-dextrano. Los radios de Stokes de los marcadores fueron representados versus (log K_av)^1/2; siendo K_av = (V_e-V₀)/(V_t-V₀).

Siguiendo con la caracterización, determinamos también el coeficiente de sedimentación.

Fig. 4: estimación del coeficiente de sedimentación. Se prepararon gradientes lineales. La muestra fue disuelta en 250 μl y después de centrifugar se recogieron fracciones de 200 μl desde la parte inferior a la parte inferior de los tubos. Se midió la actividad de PBG-D (o) utilizando el ensayo enzimático habitual. Se usaron como marcadores peroxidasa (per), fosfatasa alcalina (FA) y citocromo c (cit c), y su posición se indica con (↓)

Finalmente, determinamos la composición aminoacídica de la PBG-D.

Aminoácido	Moles de residuos/mol de proteínaa
Asx	41,7
Thrb	29,6
Serb	33,2
Glx	59,2
Pro	18,6
Gly	41,8
Ala	30,6
Cysc	5,6
Val	20,6
Met	6,7
Ile	11,1
Leu	30,5
Tyr	9,7
Phe	12,8
Trp	n.d.d
Lys	18,8
His	8,4
Arg	14,5

^a Residuos por mol de proteína (peso molecular: 42000).

^b Valores obtenidos por extrapolación a tiempo de hidrólisis cero.

^c Medido después de la oxidación con ácido perfórmico de las cistinas.

^d n.d., no determinado.

Las muestras de enzima purificada (50 μg) fueron hidrolizadas bajo vacío en HCl 6 M conteniendo 1 mg/ml de fenol durante 20 a 40 horas a 110ºC para realizar un análisis aminoacídico. El contenido de cisteínas más cistinas se estimó como ácido cisteico luego de la oxidación con ácido perfórmico, anteriormente a la hjdrólisis. La composición aminoacídica se midió con un analizador de aminoácidos Beckman 119 CL.