Objetivo: amplificar un fragmento de ADN que codifica una enzima cuya actividad posteriormente mediremos, la fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (PEPCK), mediante la técnica de PCR y realizar una corrida electroforética con el mismo.
Parte experimental:
Programa BM 2008:
1) 95ºC – 3 minutos
2) 95ºC – 1 minuto
3) 55ºC – 30 segundos
4) 72ºC – 1 minuto
5) 72ºC – 10 minutos
Se realizan 25 ciclos de 2) a 4).
Total: 1 hora y 3 minutos
Total: 1 hora y 3 minutos
Corrimos las muestras por 30 minutos junto con los marcadores genéticos en un gel de agarosa 1%.
Resultados:
Placa A:
1: marcadores de peso molecular alto
2: marcadores de peso molecular bajo
3: fracción de menor peso molecular, en mayor concentración que en la calle 5
4: fracción de mayor peso molecular, en mayor concentración que en la calle 6
5: fracción de menor peso molecular, en menor concentración que en la calle 3
6: fracción de mayor peso molecular, en menor concentración que en la calle 4
7: sin siembra
Placa B:
1: sin siembra
2: marcadores de peso molecular alto
3: marcadores de peso molecular bajo
4: fracción de menor peso molecular
5: fracción de mayor peso molecular
6 y 7: sin siembra
Conclusiones: la placa B se realizó para tener un control más de la corrida, sin duplicado. No se sembró en las calles de los costados (1, 6 y 7) para evitar el efecto de bordes. Como se puede observar, hubo diferencias en la amplificación de la fracción de mayor peso molecular con respecto a la de menor peso molecular, a pesar de que las condiciones en la programación de la PCR fueron las mismas. Si uno quisiera determinar el peso molecular de la fracción de menor peso molecular se haría dificultoso ya que la corrida de los patrones utilizados da bandas difusas.
Consideraciones generales:
La técnica de la PCR tiene como principal objetivo amplificar en forma abundante una secuencia de ADN de interés, requiriendo para ello muy poco producto inicial. Para realizar una PCR, se debe conocer de manera precisa la secuencia de nucleótidos del ADN, a fin de desarrollar oligonucleótidos o iniciadores específicos para esta.
La PCR utiliza ciertos pasos de la duplicación del ADN. La ADN polimerasa usa ADN de hebra simple como molde para sintetizar una hebra de ADN complementaria. En su forma más rudimentaria, la PCR consiste de tres pasos:
a. Un paso de desnaturalización: el ADN se incuba a una alta temperatura para generar ADN de hebra simple.
b. Un paso de alineación: donde se promueve un descenso súbito de la temperatura para que los oligonucleótidos (o iniciadores) se unan a las regiones complementarias blanco de la amplificación.
c. Un paso de extensión: la polimerasa se une a los iniciadores y comienza la síntesis de la hebra de ADN complementaria. Este paso se realiza a una temperatura intermedia.
d. Un paso de terminación: En este paso se terminan de copiar totalmente las cadenas incompletas, se realiza a una temperatura mayor que el paso de extensión, por un tiempo más largo, cuando terminan todos los ciclos programados (a, b y c).
Una secuencia completa de los primeros 3 pasos se denomina ciclo térmico. Un protocolo típico de PCR involucra de ~30 a 35 ciclos térmicos. En teoría, cada ciclo duplica la cantidad de material genético; el resultado final es la amplificación de una secuencia de ADN deseada. Por lo general, se amplifican secuencias de ADN que oscilan entre 50 a 1 500 pares de bases.
Los fragmentos de ADN amplificados pueden ser visualizados en geles de agarosa o de acrilamida, la elección del tipo de gel dependerá del tamaño del ADN amplificado y la resolución de las bandas del ADN que se generen. En la actualidad se han desarrollado muchas variantes de esta técnica. Una de las más conocidas es SSCP (single strand conformation polimorphism), que se utiliza para el tamizaje de mutaciones. En la actualidad se han desarrollado equipos automatizados que realizan la detección del fragmento amplificado; su aplicación es para el tamizaje de virus o bacterias (HIV, tuberculosis y clamidia, por ejemplo).
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