Semana 7 (24/06)

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES

OBJETIVO:

1) Evaluar perfiles proteicos obtenidos por SDS-PAGE de diferentes muestras de hígado de ratón.

2) Correlacionar la movilidad de las proteínas separadas con su masa molecular.

3) Comprobar la efectividad de la centrifugación diferencial para obtener una muestra más “limpia” para medir luego actividades enzimáticas en la misma.

PARTE EXPERIMENTAL

1. Preparación de las placas de vidrio:

Limpiar bien las placas de vidrio con alcohol y una vez secas colocarlas en los armadores interponiendo los separadores correspondientes entre ambas. La placa de vidrio más grande es la posterior. Mover las llaves laterales del armador y asegurarse que queden firmemente sujetos al soporte.

2. Preparación de los geles.

Se correrán geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 15% y 10% de T con SDS según la técnica de Laemmli.

		Gel separador 10%T
Acrilamida/bis (stock 30%T/2,67%C)		2,7 mL
Tris-HCl 1.5 M pH:8.8		2,0 mL
SDS 10%w/v		80 µL
H2O destilada		3,17 mL
APS 10%		40 µL
TEMED		6 µL
Volumen total		8 mL

Cargar los geles con aproximadamente 4 mL de la solución de gel separador y luego adicionar suavemente H₂O destilada en la parte superior con una piseta, para evitar el contacto con el oxígeno del aire. No moverlos hasta que gelifiquen, lo cual se verá por la formación de una interfase. Volcar el agua y llenarlos con el gel stacking (gel concentrador).

Gel concentrador 4%

Acrilamida/bis (stock 30%T/2,67%C)	0.53 mL
Tris-ClH 0.5 M pH: 6.8	1 mL
SDS 10%w/v	40 mL
H2O destilada	2.41 mL
APS (persulfato de amonio) 10%	20 mL
TEMED	4 mL
Volumen total	4 mL

Colocar inmediatamente los peines en la parte superior evitando la formación de burbujas y cuidando que queden derechos.

3. Armado de las cubas.

Retirar el peine y colocar la placa en la cuba de electroforesis colocando el vidrio delantero hacia la parte interna de la cuba.

Llenar la cuba con el buffer de corrida y proceder al sembrado de las muestras.

Preparación y siembra de las muestras.

Se tratan las muestras y los estándares de PM con igual volumen del buffer de siembra. Calentar 5 minutos a 100°C, enfriar y sembrar 20 ml de las muestras como máximo. La muestras deben tener una concentración de proteínas entre 20-30 mg/ 10 mL.

Corrida electroforética.

Se conecta la cuba a la fuente de poder y se corren a 80 V-1/2 hora y 130 V aproximadamente 1 hora, hasta que el colorante llegue a la parte inferior del gel.

Fijación y tinción.

Se desarma la cuba, se retira el gel de las placas de vidrio y se mide la distancia recorrida por el colorante. Se procede a la fijación y tinción de las bandas proteicas.

Tinción con Coomassie Blue.

Agregar la solución del colorante Coomassie Blue (tinción rápida), dejarlo al menos 30 minutos y desteñir con solución lavadora hasta que las bandas proteicas sean visibles. Si los geles no se van a teñir luego de la corrida fijarlo con TCA 12.5 % durante 1 hora o más.

RESULTADOS:

Calles 1, 2 y 3: homogenatos de hígado de ratón (ver semana 5)

Calles 4 y 5: fracción sobrenadante obtenido luego de centrifugar el homogenato a 11.000xg

Calle 6: seroalbúmina bovina pura

Calle 7: estándares de peso molecular (1mg/mL), volumen de siembra 5mL: fosforilasa (Mr 97.400); seroalbúmina bovina (Mr 66.000); ovoalbúmina (Mr 45.000); anhidrasa carbónica (Mr 30.000).

Calle 8: seroalbúmina bovina impura

Para determinar el peso molecular de las proteínas mayoritarias en el homogenato se realizó un gráfico de Rf vs log PM. (hacer)

Se observan tres bandas mayoritarias de peso molecular cercano a 60.000, de las cuales en el sobrenadante posterior a la centrifugación se observa la conservación de una sola de ellas, con lo cual podemos especular que la centrifugación que precipita mitocondrias reduce sustancialmente el contenido proteico del homogenato, y esto resulta beneficioso para medir en forma más “limpia” las actividades enzimáticas tales como glucosa 6-fosfato-deshidrogenasa, enzima regulatoria del camino de las pentosas.

Movilidad relativa(Rf) =Migración de la proteína/Migración del colorante

Bibliografía

- Neville, D.M. J.Biol Chem. (1971) 246: 6328-6334.

- Laemmli, U.K. Nature (1970) 227: 680- 685.

- Merril, C.R., Harrington, M., Alley, V. Electrophoresis (1984) 5: 289-297.

- Blum, H., Beier, H., Gross, H.J. Electrophoresis (1978) 8: 93-99.

Apéndice - Reactivos de electroforesis

1) Acrilamida / bis (30% T, 2.67 % C)

Acrilamida 29.2g

Bis-acrilamida 0.8g

Volumen total 100 mL

2) Buffer de corrida.

Tris 25mM- glicina 192mM -SDS 0.1%. pH: 8,3 (5X)

Para 1L de buffer: Tris Base.............15g

Glicina.................72g

SDS.....................5g

Para usar diluir 1:5 con agua destilada.

3) Buffer Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 (1X):

90.75 g de Tris y ajustar el pH a 8.8 con HCl 4 N. Llevar el volumen a 500 mL con agua destilada.

4) Buffer Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 (1X):

15.13 g de Tris y ajustar el pH a 6.8 con HCl 4 N. Llevar el volumen a 250 mL con agua destilada.

5) Buffer de siembra:

Agua destilada	4.8 mL
Tris-ClH 0.5 M pH:6.8	1.2 mL
Glicerol	1.0 mL
SDS 10%(p/v)	2.0 mL
Azul de Bromofenol 0.1% (p/v)	0.5 mL
b-mercaptoetanol	0.5 mL
Volumen total	10.0 mL

6) Solución fijadora:

Solución de Ácido tricloroacético al 12.5 %

7) Reactivos para tinción con Coomassie Brilliant Blue:

a) Coomassie Brilliant Blue R-250 0.15% en solución de Metanol (30%): Ácido acético (10%).

b) Solución para desteñir: Ácido acético 7%: metanol 5%.

Consideraciones generales

Gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (PAGE-SDS).

Este medio soporte es un polímero de acrilamida entrecruzada con N,N'-dimetil- bis-acrilamida. Con una proporción del 2% de bisacrilamida la mezcla ya puede gelificarse, pero el diámetro de poro depende de la concentración total de acrilamida. Sin embargo, a cualquier concentración dada de acrilamida total el diámetro del poro, tiene un mínimo cuando la concentración de bis es del 5%. La formación de poliacrilamida por polimerización de los monómeros se produce en presencia de radicales libres; éstos son provistos por la fotodescomposición de la riboflavina en presencia de luz ultravioleta o fluorescente. La adición de TEMED (N, N, N’, N’, tétrametil-etilendiamina) es ventajosa como catalizador de la polimerización. Otra base usada es el dimetil amino propionitrilo en vez de TEMED. La gelificación se retarda manteniendo la mezcla a temperatura cercana a los 0° C.

El equipo utilizado para corridas electroforéticas en este medio soporte, consta de una fuente de poder, dos reservorios, uno superior y otro inferior para el buffer, conectados entre sí por tubos o placas de vidrio que contienen al gel.

ESQUEMA DE UN EQUIPO DE ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

Determinación de PM por PAGE-SDS:

La posibilidad de distinguir entre tamaño y diferencias de carga en las proteínas permitiría por ejemplo decidir cuál es el paso siguiente en un proceso de purificación, o sea algún método de separación basado en diferencias de tamaño molecular (filtración por geles), o cromatografía de intercambio iónico, sí se separan en base a carga.

Si se agrega a la solución proteica urea o sodio-dodecil-sulfato (SDS), se pueden correr geles que permiten separar las subunidades de las proteínas y determinar luego su peso molecular.

Cuando la estructura terciaria de las proteínas está además mantenida por puentes S-S, es necesario desarrollar la corrida previo tratamiento de la muestra con mercaptoetanol u otro agente reductor. Cuando se corre el gel en presencia de SDS (sodio dodecil sulfato) se separan las subunidades proteicas de acuerdo a su tamaño molecular y no ya a su densidad de carga, dado que el detergente produce uniformidad en las cargas. Las proteínas migran como aniones, y en esas condiciones se establece una relación lineal inversa entre la distancia de migración (expresada como movilidad relativa) y el log PM.




BIBLIOGRAFÍA.

1) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Volume I. T.5. Wrok and E. Work North-Holland Publishing Company.

2) Paper Chromatography and Electrophoresis. Volume I. Gunter Zwerg & John R. WMtaker (Academic Press) 1967.

3) Electroforesis. Juan Miguel Castagnino. Eudeba. :

4) H. Ramer Maurer, Desc. Electrophoresis and Relaled Techniques by Polyacrylamide Gel Eleclrophoresis; Ed. Walter de Gruyter & Co., Berlín, 1971.

Semana 6 (17/06)

Como anunciamos en la entrada anterior, esta semana realizamos cromatografías en placa delgada. La fase fija, era una silica-gel que emitía fluorescencia cuando se la iluminaba con luz ultravioleta (254 nM). La fase móvil, era una mezcla de Diclorometano (CH2Cl2) y metanol (CH3OH), (95:5). Lo que sembramos fue Aldosterona (a), Corticosterona (b) y una mezcla de ambos (ab). Los resultados fueron los siguientes: Rf (a) = 0.22, Rf (b) =0.27.En (ab) observamos como se separaron los dos compuestos.Lo que también se puede observar, es un efecto sonrisa causado por la concentración de muestra y la cercanía con la cuba, esto disminuyó cuando realizamos un duplicado con menos concentración de muestra.

Además de la cromatografía en placa delgada, hicimos una por HPLC. Nuestro objetivo era analizar las diferencias en los picos de absorbancia (en función del tiempo de retención) de dos hormonas (aldosterona y corticosterona) al usar diferentes solventes de corrida en una cromatografía de alta presión.

Los reactivos utilizados fueron: -Aldosterona -Corticosterona -Columna de fase reversa (carbono 18)
Muestras: -Sc. de aldosterona en metanol -Sc. de corticosterona en metanol -Sc. de aldosterona en metanol:H2O 3:2 -Sc. de corticosterona en metanol:H2O 3:2


Protocolo:

Se enjuaga la jeringa (13 veces aprox.) y se toma con esta la primera muestra. Se la deja correr por 10 minutos a un flujo de 0,6 ml y presión de 1600 psi con metanol puro como solvente de corrida en una columna de fase reversa por HPLC.
Cuando termina la corrida, se enjuaga la jeringa y se repite con la segunda muestra.
Cuando termina esta, se cambia el solvente y se coloca una mezcla metanol:H2O 3:2. Se enjuaga la jeringa y se siembra la tercera muestra. Se la deja correr por 10 minutos a un flujo de 0,6 ml y presión de 3000 psi con metanol:H2O 3:2 como solvente de corrida en la misma columna.
Cuando termina la corrida, se enjuaga la jeringa y se repite con la cuarta muestra.

Resultados:
Picos de absorbancia:
Metanol puro: Aldosterona: 4,66min Corticosterona: 4,96min
Metanol:H2O : Aldosterona: 9,96min Corticosterona: 10,43min

Conclusiones: al usar metanol puro como solvente los picos de las dos hormonas se encuentran muy cerca. Esto se debe a la gran solubilidad de las hormonas en el metanol: son tan solubles que las diferencias entre una hormona y la otra afectan tan poco a la corrida que es muy difícil diferenciar los picos. Al usar una solución más polar la atracción entre el solvente y las hormonas disminuye, produciendo picos más separados (las diferencias entre las hormonas afectan de forma más apreciable la corrida). Además, los picos fueron más anchos y bajos en las corridas con metanol:H2O porque al no estar tan atraída la muestra por el solvente, es más retenida por la columna y la concentración en cada punto es menor (la muestra queda más diluida).

Semana 5 (12/06)

Realizamos una visita al Bioterio Central de la Facultas de Ciencias Exactas y Naturales UBA, guiados por Graciela Lammel (coordinadora del mismo).


Un bioterio es un lugar donde son criados y mantenidos animales (ratones, ratas, conejos, etc.), para uso experimental, en condiciones ambientales, sanitarias, nutricionales y genéticas controladas.
Debido a que las condiciones de infraestructura, desarrollo y consolidación de bioterios son variables en los diferentes centros de investigación, existen normas que constituyen las referencias mínimas que deben tomarse en cuenta para su manejo. Es necesario que las condiciones en las que se cria a los animales estén estandarizadas porque el animal presenta muchas variables que pueden afectar los resultados de la experimentación: la cepa, el nivel es estrés, la dieta, la etapa de crecimiento, etc.
Existen algunas recomendaciones y regulaciones internacionales promovidas por el Consejo Internacional para la Ciencia de los Animales de Laboratorio (ICLAS) que son importantes y deben de tomarse en cuenta para el buen funcionamiento de estos lugares, entre las cuales destacan:

1. Todos los animales usados con propósitos experimentales deben ser adquiridos legalmente. Su cuidado debe estar regido por normas de estricto cumplimiento y apegado a las leyes locales y estatales, así como con las regulaciones pertinentes, tanto gubernamentales como institucionales.
2. Las instituciones científicas deben contar con una Comisión Interna de Bioética y/o Bioseguridad permanente, responsable de establecer las políticas y la supervisión de los centros de investigación.
3. Los experimentos que utilicen animales vivos deben ser realizados por, o bajo la supervisión directa de un investigador calificado.
4. El alojamiento, cuidado y alimentación de todos los animales experimentales debe ser supervisado por un médico veterinario debidamente calificado o por otro investigador competente en la materia.


En el Bioterio de la UBA-FCEN se encuentran ratones, ratas, conejos y cobayos. Estos animales se encuentran en cuartos separados, especialmente preparados para reducir al mínimo el nivel de estrés de los mismos. Durante la visita utilizamos cubre-zapatos, barbijos , delantales y cofias.


Además de ir al bioterio, diseccionamos un ratón luego de haber visto a la Dra. Matkovic' hacerlo. Los ratones diseccionados habían sido utilizados como animales control para otra experimentación. Extrajimos el hígado de dos ratones para purificar las proteínas contenidas en él e hicimos un homogenato 1:3 (1g de hígado llevado a 3 ml con solución fisiólogica colocados en un potter y homogeneizado mediante varios "strokes" realizados con el enbolo de teflón en aparato marca Precytec ). Luego se centrifugó parte de la suspensión en una ultracentrífuga durante 10 minutos a 11000 x g y a 4ºC. Todo el trabajo se realizó en frío para mantener inactivas a las proteasas. Así comenzamos con el proceso de obtención y purificación de proteínas a partir de un tejido para su posterior análisis.


Actividad: disección de un ratón.

El ratón de laboratorio es un roedor, usualmente de la especie Mus musculus, que se utiliza para la investigación científica. Con frecuencia los ratones de laboratorio son blancos, y algunos son albinos.
Los ratones de laboratorio deben pertenecer a una cepa pura o endogámica.
Los individuos de una misma cepa llevan los mismos genes, por lo cual se facilita la comparación de los efectos de los diferentes tratamientos (fármacos, entorno físico, etc.) sin que se produzca confusión debido a las diferencias genéticas. La cepa más utilizada ha sido la C57, aunque existen disponibles muchas variedades, especialmente desde el desarrollo de técnicas de manipulación de genes que han provisto una gran cantidad de cepas con modificaciones genéticas particulares.
Las características que han hecho del ratón de laboratorio el modelo biológico y biomédico más utilizado en las investigaciones científicas son:
1. Fácil manejo
2. Tamaño apropiado para la crianza y manipulación
3. No requieren demasiados cuidados.
4. Tienen un sistema inmune similar al de los seres humanos.
5. Tienen un alto número de crías.
6. Poseen un breve período de gestación (19-21 días) y rápido destete.
7. Las hembras producen un gran número de óvulos, los cuales al ser
fecundados son muy resistentes.
8. Al ser mamíferos euterios, al igual que el hombre, tienen un genoma
muy similar a los humanos.

Semana 4 (05/06)

En nuestro trabajo es muy importante la purificación enzimática para poder llevar a cabo muchas de las actividades planteadas. Por lo tanto, en esta clase aprendimos a utilizar una ultracentrífuga y realizamos una separación cromatográfica por tamizaje molecular.


ULTRACENTRÍFUGA

A modo demostrativo, realizamos un homogenato de hígado de ratón en un buffer isotónico, el cual centrifugamos en una ultracentrífuga a 100.000 rmp durante 60 minutos. De esta manera en el sobrenadante quedó enzima citosólica y en el precipitado retículo endoplasmático rugoso y liso.


CROMATOGRAFIA DE TAMIZ MOLECULAR

Consideraciones generales:

El medio soporte en esta cromatografía es un dextrano entrecruzado con epiclorhidrina que permite el pasaje de moléculas de cierto tamaño al interior del gel. Cuando se pasa una solución de un material biológico a través de una columna de este material, las partículas pequeñas entrarán dentro de las del gel y recorrerán mayor distancia que las moléculas grandes, que al no poder penetrar en la red, sólo recorren el espacio entre partículas. El resultado es que las moléculas grandes eluyen directamente y las pequeñas salen retrasadas. Así, el orden de elución estará directamente relacionado con el tamaño de las moléculas.



Equipo de FPLC con columna de tamiz molecular

Objetivos

1) Determinar parámetros cromatográficos de una columna de Sephadex G-25 mediante la siembra y elución de una mezcla de blue-dextrano y cloruro de cobalto.
2) Desalado de muestras proteicas antes de su siembra en electroforesis. Esto es indispensable si se desea realizar con posterioridad una electroforesis, ya que la presencia de sales distorsiona las bandas.

Reactivos

Blue-dextran (Azul dextrano)
Solución de CoCl2
Solución de BaCl2
Reactivo de Bradford
Buffer fosfato de sodio 50 mM.

Parte experimental

1) Determinación de Vo y Vt de la columna a utilizar.

La metodología a seguir será la siguiente:

- Abrir la llave de la columna y dejar fluir el líquido con el cual se equilibra la columna. El relleno de la columna nunca debe dejarse secar. Cerrar la llave cuando queda aproximadamente 1mL.

- Sembrar la solución coloreada (0,1mL). Abrir la llave dejando entrar la muestra al mismo tiempo que se comienza a recolectar fracciones del eluido (0,5mL). Se procede así hasta que el volumen del líquido que ha atravesado la columna sea una vez el volumen total de la misma. En ese momento se cierra la llave, terminando la recolección de fracciones. El tiempo de goteo debe ser entre 12 y 15 segundos.

- Se determina cualitativamente Vo: volumen en que se observa el pico de coloración del Blue dextrano. Se determina Vt: volumen en que se observa el pico de coloración del cloruro de cobalto. Se graficó el perfil de elución obtenido por asignación de unidades arbitrarias a la intensidad de color de cada uno en función del volumen eluído.

Resultados y conclusiones:





Gráfico: medición cualitativa de los diferentes tubos de Blue-dextrano y cloruro de cobalto.

Concluímos que sembrando muestras de pequeño volumen el desalado es más efectivo ya que el solapamiento entre las dos gaussianas es menor. Por lo tanto procedimos a desalar las muestras que van a ser posteriormente sembradas en la corrida electroforética.

Bibliografía

P.Andrews, Biochem. J. (1964) 91: 222.

P. Flodin, J. Chromat. (1961) 5: 103.

M. Paget and P. Coustenoble, Ann. Biol. Clin. (1966), 24: 181.