Semana 4 (05/06)

En nuestro trabajo es muy importante la purificación enzimática para poder llevar a cabo muchas de las actividades planteadas. Por lo tanto, en esta clase aprendimos a utilizar una ultracentrífuga y realizamos una separación cromatográfica por tamizaje molecular.


ULTRACENTRÍFUGA

A modo demostrativo, realizamos un homogenato de hígado de ratón en un buffer isotónico, el cual centrifugamos en una ultracentrífuga a 100.000 rmp durante 60 minutos. De esta manera en el sobrenadante quedó enzima citosólica y en el precipitado retículo endoplasmático rugoso y liso.


CROMATOGRAFIA DE TAMIZ MOLECULAR

Consideraciones generales:

El medio soporte en esta cromatografía es un dextrano entrecruzado con epiclorhidrina que permite el pasaje de moléculas de cierto tamaño al interior del gel. Cuando se pasa una solución de un material biológico a través de una columna de este material, las partículas pequeñas entrarán dentro de las del gel y recorrerán mayor distancia que las moléculas grandes, que al no poder penetrar en la red, sólo recorren el espacio entre partículas. El resultado es que las moléculas grandes eluyen directamente y las pequeñas salen retrasadas. Así, el orden de elución estará directamente relacionado con el tamaño de las moléculas.



Equipo de FPLC con columna de tamiz molecular

Objetivos

1) Determinar parámetros cromatográficos de una columna de Sephadex G-25 mediante la siembra y elución de una mezcla de blue-dextrano y cloruro de cobalto.
2) Desalado de muestras proteicas antes de su siembra en electroforesis. Esto es indispensable si se desea realizar con posterioridad una electroforesis, ya que la presencia de sales distorsiona las bandas.

Reactivos

Blue-dextran (Azul dextrano)
Solución de CoCl2
Solución de BaCl2
Reactivo de Bradford
Buffer fosfato de sodio 50 mM.

Parte experimental

1) Determinación de Vo y Vt de la columna a utilizar.

La metodología a seguir será la siguiente:

- Abrir la llave de la columna y dejar fluir el líquido con el cual se equilibra la columna. El relleno de la columna nunca debe dejarse secar. Cerrar la llave cuando queda aproximadamente 1mL.

- Sembrar la solución coloreada (0,1mL). Abrir la llave dejando entrar la muestra al mismo tiempo que se comienza a recolectar fracciones del eluido (0,5mL). Se procede así hasta que el volumen del líquido que ha atravesado la columna sea una vez el volumen total de la misma. En ese momento se cierra la llave, terminando la recolección de fracciones. El tiempo de goteo debe ser entre 12 y 15 segundos.

- Se determina cualitativamente Vo: volumen en que se observa el pico de coloración del Blue dextrano. Se determina Vt: volumen en que se observa el pico de coloración del cloruro de cobalto. Se graficó el perfil de elución obtenido por asignación de unidades arbitrarias a la intensidad de color de cada uno en función del volumen eluído.

Resultados y conclusiones:





Gráfico: medición cualitativa de los diferentes tubos de Blue-dextrano y cloruro de cobalto.

Concluímos que sembrando muestras de pequeño volumen el desalado es más efectivo ya que el solapamiento entre las dos gaussianas es menor. Por lo tanto procedimos a desalar las muestras que van a ser posteriormente sembradas en la corrida electroforética.

Bibliografía

P.Andrews, Biochem. J. (1964) 91: 222.

P. Flodin, J. Chromat. (1961) 5: 103.

M. Paget and P. Coustenoble, Ann. Biol. Clin. (1966), 24: 181.