Semana 6 (17/06)

Como anunciamos en la entrada anterior, esta semana realizamos cromatografías en placa delgada. La fase fija, era una silica-gel que emitía fluorescencia cuando se la iluminaba con luz ultravioleta (254 nM). La fase móvil, era una mezcla de Diclorometano (CH2Cl2) y metanol (CH3OH), (95:5). Lo que sembramos fue Aldosterona (a), Corticosterona (b) y una mezcla de ambos (ab). Los resultados fueron los siguientes: Rf (a) = 0.22, Rf (b) =0.27.En (ab) observamos como se separaron los dos compuestos.Lo que también se puede observar, es un efecto sonrisa causado por la concentración de muestra y la cercanía con la cuba, esto disminuyó cuando realizamos un duplicado con menos concentración de muestra.

Además de la cromatografía en placa delgada, hicimos una por HPLC. Nuestro objetivo era analizar las diferencias en los picos de absorbancia (en función del tiempo de retención) de dos hormonas (aldosterona y corticosterona) al usar diferentes solventes de corrida en una cromatografía de alta presión.

Los reactivos utilizados fueron: -Aldosterona -Corticosterona -Columna de fase reversa (carbono 18)
Muestras: -Sc. de aldosterona en metanol -Sc. de corticosterona en metanol -Sc. de aldosterona en metanol:H2O 3:2 -Sc. de corticosterona en metanol:H2O 3:2


Protocolo:

Se enjuaga la jeringa (13 veces aprox.) y se toma con esta la primera muestra. Se la deja correr por 10 minutos a un flujo de 0,6 ml y presión de 1600 psi con metanol puro como solvente de corrida en una columna de fase reversa por HPLC.
Cuando termina la corrida, se enjuaga la jeringa y se repite con la segunda muestra.
Cuando termina esta, se cambia el solvente y se coloca una mezcla metanol:H2O 3:2. Se enjuaga la jeringa y se siembra la tercera muestra. Se la deja correr por 10 minutos a un flujo de 0,6 ml y presión de 3000 psi con metanol:H2O 3:2 como solvente de corrida en la misma columna.
Cuando termina la corrida, se enjuaga la jeringa y se repite con la cuarta muestra.

Resultados:
Picos de absorbancia:
Metanol puro: Aldosterona: 4,66min Corticosterona: 4,96min
Metanol:H2O : Aldosterona: 9,96min Corticosterona: 10,43min

Conclusiones: al usar metanol puro como solvente los picos de las dos hormonas se encuentran muy cerca. Esto se debe a la gran solubilidad de las hormonas en el metanol: son tan solubles que las diferencias entre una hormona y la otra afectan tan poco a la corrida que es muy difícil diferenciar los picos. Al usar una solución más polar la atracción entre el solvente y las hormonas disminuye, produciendo picos más separados (las diferencias entre las hormonas afectan de forma más apreciable la corrida). Además, los picos fueron más anchos y bajos en las corridas con metanol:H2O porque al no estar tan atraída la muestra por el solvente, es más retenida por la columna y la concentración en cada punto es menor (la muestra queda más diluida).